隨著(zhù)技術(shù)的進(jìn)步，分子診斷產(chǎn)品發(fā)展的越發(fā)成熟，按照技術(shù)原理，可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為數字PCR技術(shù)、分子雜交、基因測序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類(lèi)。未來(lái)3-5年IVD行業(yè)最具發(fā)展潛力的產(chǎn)品線(xiàn)是什么？答案無(wú)疑是分子診斷。狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)。

隨著(zhù)基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內涵已經(jīng)從DNA/RNA拷貝、突變等檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測。從目前市場(chǎng)分子診斷產(chǎn)品來(lái)看，基于核酸診斷技術(shù)的產(chǎn)品仍占主流位置。

分子診斷技術(shù)體系:

PCR

從各類(lèi)技術(shù)類(lèi)別來(lái)看，PCR技術(shù)由于壁壘相對較低，國產(chǎn)化程度高，國內企業(yè)布局相對較早，因此基于PCR技術(shù)的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。PCR技術(shù)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理是在反應室中模擬細胞內的DNA復制，即人為創(chuàng )造核酸半保留復制條件，使目的DNA在細胞外完成擴增的過(guò)程。通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行分子診斷的流程如下：核酸提取——核酸擴增——核酸檢測。按照靶標數量劃分，PCR技術(shù)平臺通?？煞譃閝PCR和ddPCR。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

Real-time PCR，美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來(lái)實(shí)現其定量功能的，與普通PCR相比，實(shí)時(shí)定量PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板的定量分析。

ddPCR（數字PCR）

ddPCR系統利用油包水技術(shù)，在傳統的PCR擴增前將一個(gè)大的反應體系進(jìn)行微滴化處理，將此反應體系分割為成千上萬(wàn)個(gè)微滴，即成千上萬(wàn)個(gè)獨立的PCR反應體系。在此過(guò)程中，樣品被稀釋至單分子水平，并被平均分配到這幾萬(wàn)個(gè)反應體系中，每個(gè)微滴中不含或者含有至少一個(gè)待檢測的核酸靶分子，這樣也相當于變相的對靶基因進(jìn)行富集。目前，國內市場(chǎng)已現10余家數字PCR儀廠(chǎng)商，其中領(lǐng)航基因自主研發(fā)的數字PCR系統已獲NMPA認證，銳訊生物、新羿生物、STILLA、伯樂(lè )還在申報中。

核酸測序

經(jīng)典的Sanger測序技術(shù)，被稱(chēng)作是測序屆金標準。隨著(zhù)高通量測序技術(shù)應用拓展，基因測序技術(shù)將不斷升級，也將進(jìn)一步提高占比，成為未來(lái)腫瘤檢測的主要技術(shù)。目前測序市場(chǎng)主流為NGS測序平臺。

二代測序（NGS）在臨床領(lǐng)域的應用快速增漲，其在臨床上的應用主要包括疾病目標基因集測序（disease-targeted gene panels）、全外顯子組測序（whole exome sequencing , WES）和全基因組測序（whole genome sequencing , WGS）?？傮w來(lái)說(shuō)，NGS技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內對感興趣的基因進(jìn)行精確定位。

在二代測序領(lǐng)域，筆者知道的測序平臺就達三十多個(gè)，Illumina毫無(wú)疑問(wèn)是行業(yè)巨頭，其市場(chǎng)規模甚至達到壟斷地步。目前已獲中國國家藥品監督管理局醫療器械批準的基因測序儀包括：Illumina MiSeq?Dx;華大智造BGISEQ-100、BGISEQ-1000、BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000、MGISEQ-200共6款基因測序儀。

單細胞測序，第三代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序，單分子測序平臺給測序技術(shù)帶來(lái)新思路，部分已經(jīng)開(kāi)始商業(yè)化推廣，但尚未達到NGS的規模。相比二代測序，第三代測序技術(shù)在臨床上的應用有明顯優(yōu)勢：第三代測序技術(shù)不需要PCR擴增，可直接對單個(gè)分子進(jìn)行測序;樣品制備簡(jiǎn)單，測序成本進(jìn)一步降低；可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內的DNA修飾。這些優(yōu)勢可以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質(zhì)量，但單分子測序有通量限制，所以并不適合獨立做全基因組測序，更適于針對有限的、個(gè)性化的、目標性的應用。

幾家重要的單分子測序平臺一覽：

Helicos BioSciences：第一臺真正的單分子測序儀

Pacific Biosciences（PacBio）：首個(gè)單分子實(shí)時(shí)測序系統

Oxford Nanopore Technologies：納米孔測序、迷你測序儀

分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA 變性與復性的原理，把不同的DNA 單鏈分子或者DNA 與RNA 的混合物放在同一溶液中，在某種理化因素作用下DNA 雙鏈分子解鏈變性，這樣互補序列的DNA 之間或DNA 與RNA 之間形成雜化的雙鏈。

核酸分子雜交技術(shù)可分為Southern 雜交——DNA和DNA分子之間的雜交；Northern雜交——DNA和RNA分子之間的雜交。

蛋白雜交，也叫Western 雜交，蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法，即蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交。

核酸質(zhì)譜

目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。 簡(jiǎn)單來(lái)講，兩種電離技術(shù)都是軟電離，ESI 檢測的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷，質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區間，從而能檢測幾萬(wàn)乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到單電荷峰，與飛行時(shí)間（TOF）分析器搭配，檢測范圍可以到幾十萬(wàn)道爾頓。

Agena MassARRAY 核酸質(zhì)譜

質(zhì)譜技術(shù)相比于其他檢測技術(shù)具有快速、準確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在核酸的高級結構鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領(lǐng)域有著(zhù)廣泛的應用。

由于生物樣品的復雜性，質(zhì)譜技術(shù)還面臨著(zhù)一些挑戰和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具，隨著(zhù)臨床實(shí)驗室對質(zhì)譜的了解和應用不斷的加深，未來(lái)該檢測平臺或可成為規范實(shí)驗室不可或缺的標準裝備。

生物芯片

微陣列芯片

也就是常說(shuō)的基因芯片，又稱(chēng)DNA微陣列（DNA micro-array）、SNP芯片，是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片（如玻片、膜）上，經(jīng)過(guò)標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，通過(guò)檢測雜交信號，對生物細胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。

與傳統的染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的分辨率，可識別Kb級別以上的染色體細微失衡?；蛐酒壳耙殉蔀閲鴥韧馀R床遺傳學(xué)診斷的一項常規的技術(shù)，在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測、個(gè)性化用藥等方面均呈現出廣闊的應用前景。

全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix（于2016年被賽默飛收購）、安捷倫等。

微流控芯片

微流控芯片（ microfluidic chip） 由微米級流體的管道、反應器等元件構成，與宏觀(guān)尺寸的分析裝置相比，其結構極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比，以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在內的特殊性能，從而在一張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預處理、分子生物學(xué)反應、檢測等系列實(shí)驗過(guò)程。目前使用微流控芯片進(jìn)行指導用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測是主要臨床應用領(lǐng)域。

分子診斷的高速發(fā)展離不開(kāi)分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。

在過(guò)去的50 年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉化與3項提升：報告信號檢測從放射核素標記向熒光標記轉化、操作方法由手工操作向全自動(dòng)化轉化、檢測分析通量從單一標志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉化。

不僅如此，儀器檢測靈敏度、精密度、特異性的也有快速提升。隨著(zhù)分子診斷技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，分子診斷將會(huì )出現理念的革命性進(jìn)步，高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實(shí)際應用中。具體如何發(fā)展，我們拭目以待。

分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常，以確定受檢者有無(wú)基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。